熒光定量PCR實驗指南

1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；

2、引物、探針的設(shè)計；

3、引物探針的合成；

4、反應(yīng)體系的配制；

5、反應(yīng)條件的設(shè)定；

6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化；

7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；

8、標(biāo)準(zhǔn)品的制備；

從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)點(diǎn)的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開某個序列后，直接“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，“file”菜單中的“import”，打開后“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，“file”菜單中的“open entrez sequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后要對所有的序列進(jìn)行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的所有文件，“add” 或“add all”，然后“Done”導(dǎo)入要比較的序列，再“assemble”進(jìn)行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時要設(shè)定比較序列的開始與結(jié)尾。有時因為參數(shù)設(shè)置的原因，可能分為幾組（contig），若想全部放在一組中進(jìn)行比較，就調(diào)整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimum math percentage”默認(rèn)設(shè)置為80，可調(diào)低即可。再選擇幾個組，“contig”菜單下的“reassemble contig”即可。選擇高低的原則是在所分析的序列在一個“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時因此個別序列原因，會出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對“contig”的序列的排列進(jìn)行修改，確保排列是每個序列的真實且排列同源性的排列。然后，“save”保存即可。分析時，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不可用的。

2.1引物設(shè)計  

細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計是PCR中重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：

²    序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；

²    擴(kuò)增片段長度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別：
sybr green I技術(shù)對片段長度沒有特殊要求；
Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp－150bp；

²    避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；

²    避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

²    典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；

²     引物之間的TM相差避免超過2℃；

²     引物的3’端避免使用堿基A；

²     引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。

²     為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計能跨兩個外顯子。

2.2  Taqman 探針設(shè)計 一般設(shè)計原則：

²     探針位置盡可能地靠近上游引物；

²     探針長度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。

²     探針的5’端應(yīng)避免使用堿基G。

²     整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。

²     為確保引物探針的特異性，將設(shè)計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。（www.ncbi.nlm.nih/blast）

2.3  Taqman  MGB 探針設(shè)計介紹

MGB探針的優(yōu)點(diǎn)：

²     MGB探針較短（14-20bp），更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。

²     短片段探針（14-20bp）加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達(dá)到熒光探針Tm值的要求。

²     MGB探針的設(shè)計原則

²    探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹€堿基，與報告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號。

²     用primerexpress軟件評價Tm值，Tm值應(yīng)為65-67℃。

²     盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。

²     盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。

²     原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到（MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號）。因此，在進(jìn)行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點(diǎn)可向3’端移動，但突變位點(diǎn)至少在離3’端2個堿基的前方（即必須確保探針的后兩個堿基是的保守），以進(jìn)行SNP檢測。反過來，若要進(jìn)行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個bp,探針仍不保守。有幾個突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設(shè)計簡并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測到突變。

2.4 實時多重PCR探針的選擇：

多重實時PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標(biāo)記探針，在檢測時可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴(kuò)增不同長度的目的片段，反應(yīng)中加入SYBRN染料，后根據(jù)不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。

多重實時PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時為Taqman 探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon 探針。

在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析:

設(shè)計好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計的多重探針后，在“report”菜單下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進(jìn)行評價（通常給出差的dG值，理論上是dG值越大越好）。

引物的設(shè)計和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計對于實時熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計意味著的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的實驗結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。

 3.1 引物退火溫度

引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。

設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機(jī)程序使用近鄰分析法——從序列結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時可以如下進(jìn)行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

引物的濃度會影響特異性。佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的濃度必須使用計算的消光系數(shù)。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。

一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/μmol），計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。

濃度（μM）＝A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD）

舉例：計算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD，代入得：

濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM

 

定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。

引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。在TE重溶引物，使其終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。

引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）多可以保存2個月。

探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。

由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。

熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點(diǎn)因為遺傳元件的定位而受*，如定點(diǎn)突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。

限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能抑制酶的活性，因此并不能消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。

熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。

Transitor® Hot Start Taq酶對于自動熱啟動PCR來說可靠。Transitor® Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴(kuò)增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機(jī)粘連而形成的非特異性擴(kuò)增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團(tuán)會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反應(yīng)中，從而恢復(fù)聚合酶活性。

鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μM dNTP的實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實性。為了確定佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用 Transitor® Hot Start Taq酶。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。

模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時就會抑制擴(kuò)增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR 反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR 反應(yīng)的成功率。

起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴(kuò)增和熒光PCR擴(kuò)增，10⁴到10⁶個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的佳模板量取決于基因組的大?。ㄏ卤恚Ｅe例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當(dāng)于3×10⁴到3×10⁵個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10－100ng的量就足夠檢測了。當(dāng)然對模板做一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴(kuò)增效率。

 

表1. 基因組大小和分子數(shù)目的比例

 

 

 

PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）。

可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫φ諜z測污染。

使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨(dú)加入。

一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴(kuò)增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因為前面的擴(kuò)增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。

 

影響PCR的因素如此之多，您有時很難區(qū)分是什么導(dǎo)致您的實驗結(jié)果不佳。降低實驗的不穩(wěn)定因素是使用可靠的產(chǎn)品。

使用、性能可靠的熱啟動酶、的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系，大程度的降低了反應(yīng)變量，提高了實驗的可重復(fù)性和可靠性。您還需要進(jìn)行以下步驟的準(zhǔn)備：設(shè)計引物和探針、合成引物和探針、正確儲藏、得到高質(zhì)量的模板，隨后，您僅需要進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的實驗結(jié)果。

FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）同競爭對手的定量PCR體系相比提供了更的結(jié)果。使用這種產(chǎn)品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時可以靈活地選擇您所喜歡的擴(kuò)增條件，檢測方法和設(shè)備。

實時定量PCR是快速增長的PCR方法，它可以、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）是一種方便使用的反應(yīng)混合液，為定量分析進(jìn)行了優(yōu)化。它包含了熒光PCR所必須的成分（如緩沖液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記探針。您就可以得到實時qPCR所需的特異性和靈活性。

FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）提供了強(qiáng)大的PCR擴(kuò)增，可以使用多個模板組。所使用的Taq DNA聚合酶具有熱啟動特性。這極大地降低和消除了錯誤配對和非特異性擴(kuò)增，使您得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止殘余污染的能力防止了非模板DNA的擴(kuò)增，從而降低了假陽性，使結(jié)果更可靠。

在產(chǎn)量和靈敏度方面，Quantitative PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）的靈敏度（閾循環(huán)）。您可以更地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內(nèi)檢測線性劑量反應(yīng)。

 

除了靈敏度和特異性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析設(shè)置，檢測方法和設(shè)備上給您提供了較高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以：

對擴(kuò)增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于提供了附加的氯化鎂，所以您可以方便地配置Mix體系。

可以更靈活的進(jìn)行普通PCR和熒光PCR。

可以在多種設(shè)備上使用，如ABI Prism® 7700, ABI GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。

可以利用多種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)，包括TaqMan®探針和Molecular Beacon，您不必局限于特定的試劑盒。

 

ð  A2010A0101試劑盒：（探針體系）
FQ-PCR MasterMix-UNG混合物（2X） 25ul（終濃度為1×）；
上游引物（終濃度為50~900nM），下游引物（終濃度為50~900nM）；
探針（終濃度為200nM）；
待檢樣品 5ul（終濃度為10~100ng）；
無菌去離子水 補(bǔ)足，使總體積達(dá)到 50ul 。

ð A2010A0106 試劑盒:
反應(yīng)體系終濃度：
1-2U的hot start Taq酶、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2－0.4mM的dNTPs、1×PCR buffer（A2010A0106）；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板,反應(yīng)總體積通常為20－50ul

ð  自配熱啟動熒光－UNG 體系：

1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0104）；0.2-1U的UNG酶（A2010A0107）、0.2－0.4mM的d（A,C,G）TPs、0.3-0.6mMdUTP（A2010A0108）；50－900nM 的上游引物、50－900nM 的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板、反應(yīng)總體積通常為20－50ul

使用高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start），大程度降低了需要優(yōu)化的參數(shù)。您只需要優(yōu)化退火溫度，就可以得到更靈敏、更可靠的定量結(jié)果。對于特殊結(jié)構(gòu)的熒光PCR，您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結(jié)果。

使用通用PCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，可以適合更多的反應(yīng)體系，如mRNA的普通RT-PCR檢測，適用于合成質(zhì)粒的PCR，同時也適用于熒光PCR，范圍更寬。

采用成套的hot start Taq酶，您需要對酶量、鎂離子濃度、UNG濃度、dUTP濃度、引物濃度、退火溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化（參照3：影響PCR及熒光PCR 的其他因素）進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的指標(biāo)越多，實驗的不確定性就越大。避免在操作中引入更大的不確定性和不可重復(fù)性。注意：同樣可參照的QPCR  MASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事項。

 

目前市場上有許多種實時PCR儀：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 （Applied Biosystems）；MX4000 （Stratagene）；iCycler （Bio-Rad）；Smartcycler（Cepheid）；Robocycler （MJ Research）；Lightcycler （Roche）；ROTORGENE（CORBERT） ；杭州博日（Linegene）。

不同的儀器使用方法有所區(qū)別，但都具備對Taqman 探針和sybgreen 染料法的檢測波長和檢測能力。QPCR  MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均適合在這些儀器上進(jìn)行使用。

為確保實驗數(shù)據(jù)的有效性，每次實驗都設(shè)陰性對照和4個標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣品都平行做2個復(fù)孔。

基線或閥值的設(shè)定 通常是以10－15個循環(huán)的熒光值作為閥值，也可以以陰性對照熒光值的高點(diǎn)作為基線。

 

8、疑難解答

 

 

1）、文獻(xiàn)上找到的引物和探針序列能否直接使用？